目前，冷冻电镜主要被一些科研机构和研究机构使用。以下是一些具有冷冻电镜的单位：

1、 美国国家标准与技术研究所（NIST）

2、 加拿大皇家科学院

3、 英国伦敦大学学院

4、 德国马克斯·普朗克生物物理研究所

5. 日本东京大学

6、 中国科学院上海利用物理研究所

7、 中国科学技术大学合肥微尺度物资科学国家实验室

8、 韩国浦项科技大学

9、 法国巴黎萨克雷大学

这些单位都有成熟的冷冻电镜技术和装备，并在各个领域进行了广泛的利用和研究。

请注意，这只是其中的一部份，实际上可能还有更多的单位具有冷冻电镜装备。

酶工程知识总结

酶工程复习小结

第一章 绪论

1.酶的发展史

1773年，意大利斯帕兰扎尼发现了鹰的胃液消化肉块。

19世纪欧洲发现酶的反应属于化学反应，与生命活动无关。

巴斯德发现发酵与活细胞有关，起发酵作用的是酵母细胞。

库恩将其命名为酶。

毕希纳发现是一种生物反应催化剂。

酶的本质研究：最初认为酶是酿酒酵母，后来发现是一种具有生物催化活性的物质，在后来发现酶是一种蛋白质，在后来发现有些酶是RNA。

生物催化剂（Biocatalytics）：通常把来源于生物并且具有催化活性的酶制剂统称为生物催化剂。生物催化剂除了从生物体分离出来的酶之外，还包括富含酶制剂的细胞碎片、细胞器、丧失生命活性的完整细胞器以及可以增值的活细胞。

酶工程是利用酶催化的作用，在一定的生物反应器当中将原料转化为所需要产品，是酶学理论与微生物技术的结合而产生的一门新技术，是酶的生产与应用过程技术。

酶的生产：通过各种方法获得人们所需要的酶的技术过程。

酶的应用：通过酶的催化作用获得人们所需要的物质或者除去不需要的物质的技术过程。在酶的应用过程当中，出现了天然酶的缺陷包括：稳定性差（对热强酸强碱）、酶的分离纯化技术复杂、只能使用一次。

酶的改良：通过各种技术和方法改良酶的催化特征的技术过程。包括酶的分子修饰、酶的固定化、酶的非水相催化体系的建立以及酶的定向进化。

酶工程的三个阶段：

酶的提取分离阶段（日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶、Rohm动物一张中提取出胃蛋白酶用于皮革洗涤和软化、木瓜蛋白酶用于啤酒澄清、细菌淀粉酶用于纺织品退浆。

酶的发酵生产阶段：微生物液体深层发酵进行淀粉—淀粉酶的改良。

工程全面化发展：易错PCR、DNA重排、基因家族重排、高通量筛选、酶的定向进化。

第二章 酶学知识

1.酶的分类与命名

酶的分类：可以分为蛋白酶和核酸类酶。其中蛋白类酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶六种，核酸酶包括分子内核酸酶（自我剪切和酶、自我剪接核酶）和分子间核酸酶（DNA、RNA、多肽、氨基酸）。羊转水裂一脸

酶的命名：习惯命名法：底物加反应特性（蛋白酶、淀粉酶）、催化反应特征（水解酶）、加来源或特征（木瓜蛋白酶、碱性磷酸酶）

系统命名法：E.C.a.b.c.d

a表示大类即分类当中的六类。

2.酶的组成和特点

单纯酶是指简单酶，只有一种催化成分，单纯蛋白质，比如：脲酶、淀粉酶、脂肪酶。蛋白质的性质决定了他的催化活性。

结合酶或全酶：是指由酶蛋白和辅助因子构成的，辅助因子包括金属离子和小分子物质，其中小分子物质又包括辅酶和辅基。辅酶结合比较松弛，辅基结合比较紧密。一般来说，全酶的酶蛋白决定了底物的专一性，辅助因子决定了反应的专一性。

辅助因子的作用：

金属离子

金属离子的作用：催化作用，参与三元络合物E-M-S的形成，稳定蛋白构象。根据金属离子与酶蛋白的结合程度可以分为两种：金属酶和金属激活酶。酶蛋白与金属离子结合紧密，比如说铁离子/亚铁离子、铜离子/亚铜离子。金属激酶：酶蛋白与金属离子结合比较松散，在溶液中酶蛋白与这类离子结合而被激活。

辅酶和辅基：

辅酶：是指与酶蛋白结合比较松散那的小分子有机物质，通过透析方法可以除去。

辅基：以共价键与酶蛋白结合，不能用透析方法除去，必须使用一定的化学处理才能够将共价键打开。

酶的组成形式：单体酶、寡聚酶、多酶复合体、多酶融合体。

单体酶：有一条肽链组成或者多条肽链通过二硫键链接形成的酶。

寡聚酶：由两个或两个以上的与亚基组成的酶。

多酶复合体：由几种酶通过共价链接形成的复合体。其中每一个酶催化一种反应所有反应依次进行。

多聚融合体：一条多肽链上链接有多种催化活性的酶，通常是由基因改造形成的。

酶的结构：包括必需基团、结构维持和活性部位（包括结合基因和催化基因）

3.酶催化

酶催化的特点：催化效率高、高特异性、酶活可调节（不同反应条件下酶活不同）

催化反应的机制：广义的酸碱催化、共价催化

4.酶反应动力学：研究酶促反应的速率以及其影响因素的科学。

5.酶活力测定：反应条件设计酶浓度、底物浓度、反应体系、条件、样品、空白和对照。

第三章 酶的蛋白合成

1.中心法则

2.蛋白表达的调控：

2.1胞内蛋白和胞外蛋白的差异：

胞内蛋白由细胞质内游离的核糖体形成，一般来说，不含信号肽，不经过内质网、高尔基体的加工。胞外蛋白是存在于细胞外的基质当中，由细胞合成之后分泌到胞外的蛋白质，绝大多数含有信号肽。

2.2操纵子、调控子、信号肽、前肽。其中操纵子和信号肽位于目的基因上游。

操纵子：操纵子包括启动基因、操纵基因以及结构基因，三者紧密相连，操纵子是三者的总称。很多功能相关的基因前后链接成串，由一个共同的控制区进行调控。常见的操纵子包括：乳糖操纵子、色氨酸操纵子等信号肽：蛋白质中由特定氨基酸组成的连续序列，决定蛋白质在细胞中的最终定位。在胞外蛋白分泌的过程中至关重要。

2.3密码子：mRNA每三个相邻碱基排列成为一个密码子，密码子决定氨基酸的种类，密码子的排列顺序决定氨基酸的排列顺序，进而决定蛋白质的一级结构。在翻译过程中会与反密码子相结合。免疫原性：指可以引起免疫应答的性能。即抗原刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞发生活化、增殖、分化，最终产生特定的免疫细胞的能力。

抗原性：抗原性是指抗原与其诱导的看抗体或致敏淋巴细胞他特异性结合的能力大小。

蛋白结构包括一级结构、二级结构。

第四章 微生物产酶

1.微生物产酶的流程

1）菌种分离筛选：土样采集、过滤、辅基、菌落培养、筛选

2）菌种优化培育

3）发酵培养基/发酵条件的优化

4）发酵产物的分离纯化

5）酶制剂的包装保存

2.微生物产酶的生化机制

1）酶的生物合成的基本过程：转录和翻译

2）生物合成的调节：

分解代谢物的阻遏作用

酶生物合成的诱导作用

酶生物合成的反馈阻遏作用

3）合成模式：同步合成型、延续合成型、中期合成型、滞后合成型。（合成模式并不是固定不变的，同一菌种在不同条件下的合成模式可能会不同。）

同步合成型：酶的合成与细胞的生长同步进行，在细胞进入平衡期之后，酶的合成停止。

延续合成型：酶的合成与细菌的生长同步进行，但是在细菌生长进入平衡期之后，酶还可以继续合成一段时间。

中期合成型：酶在细菌生长一段时间之后才开始，在细胞生长达到平衡期之后，酶的合成停止。

滞后合成型：酶合成在细胞生长开始一段时间后，在细胞生长达到平衡期之后，酶的合成还可以继续合成一段时间。

3.微生物产酶的影响因素：

优化菌株、优化培养基、优化分离技术、设备及条件、控制工艺、其他（添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂、添加促进剂）。

诱导物：能够调节启动子开关的物质称为诱导物，诱导物可以与调控蛋白结合，改变调控蛋白的空间结构，从而能改变基因转录翻译。

阻遏物：一种可以与DNA或者RNA结合来阻遏转录翻译的一种蛋白质，与操纵基因结合之后影响操纵子的蛋白结构，进而影响蛋白质合成。

表面活性剂：指具有一定的亲水疏水基因，在溶液表面横向排列，并且可以使表面张力下降的物质。促进剂：可以促进产酶，但是并不清楚其原理。

因此，发酵方式的选择、了解发酵特点、培养基的选择、优化工艺、优化发酵条件非常重要。

培养基：培养基的C/N，碳源、氮源有什么物质提供、无机盐、生长因子

发酵条件包括pH条件（缓冲体系、培养基中、流体）、温度（培养温度、发酵罐温度）、溶解氧（氧分压、通气量、气液接触时间、接触面积、改变培养液的性质）。

4.微生物发酵的优点：

1

）微生物产酶产量高。

2）微生物产酶稳定下好。

3）利于培养和管理

4）利于酶的分离纯化

5）安全可靠，无毒性。

第五章 微生物菌种改造

1.育种的分子生物学基础——突变

突变的分子机制：基因突变（碱基替换、移码突变、易位突变），染色体畸变和染色体组变（缺失和重复、倒位和易位、多倍体三倍体）

遗传性状改变：同义和无义突变、错义突变、移码突变

突变类型：形态突变型、生化突变型、条件致死突变型、致死突变型、抗性突变型。

基因突变：基因组DNA发生突然变化的，可以遗传的，变异现象。从分子水平来看，就是发生在碱基序列上的变化。

碱基替换：在DNA分子中，一个碱基被另一个碱基替换的现象。

移码突变：在正常的DNA分子中，碱基改变非3的倍数，导致在这个位置后面的所有碱基序列发生改变，导致碱基编码移位错误的现象就做移码突变。

易位突变：染色体片段发生位置改变叫做易位，其中在同一条染色体上的改变叫做移位或者染色体内易位，在不同染色体之间发生叫做染色体间易位。

染色体畸变：染色体畸变包括染色体数目的畸变和染色体形态的畸变。

同义突变：又叫沉默突变，是指DNA中的碱基改变导致mRNA的密码子发生改变，但是由于密码子并没有发挥作用，氨基酸并没有发生改变的突变。

无义突变：DNA的突变导致mRNA中的密码子改变为另一种终止密码子。

错义突变：DNA中的碱基改变导致mRNA中的密码子发生改变，编码成另一种氨基酸的突变。

形态突变型：指肉眼可见的突变型，比如说性状、大小、颜色的突变型。

2.育种前的准备——诱导细胞的选择

1）单倍体细胞

2）单核或者细胞核尽可能少。

3）诱变剂作用机理选择细胞状态

4）分离纯化

注意1）爱固定条件下培养细胞，2）利用成分固定的细胞进行实验，3）细胞充分分散，4）诱变之后表型延迟

3.育种的一般流程

1）选择出发菌株

2）出发菌株纯化

3）制备单孢子

4）诱变剂或者诱变方式的选择性

5）诱变条件的优化

4.菌种筛选

1）筛选流程的确认

2）筛选方法的确定和优化

3）筛选培养基

4）产物测定

5）突变菌株的分纯

6）突变菌株的工业化

5.育种的常见方法及原理

1）自然选育：小概率突变

2）经典诱变：物理诱变、化学诱变（烷化剂、核酸碱基类似物、抗生素）、复合诱变

产TG酶的菌种紫外诱变（制备孢子处理液、紫外处理、涂布暗箱培养、高通量初筛、摇瓶复筛、工业发酵罐放大）

亚硝基胍诱变：原理：烷化剂，是DNA上的碱基和磷酸部分被烷化，DNA复制时导致配对错误而引起突变。诱变条件：不同pH的诱变机理不同。

常温常压等离子体（ARTPA）常温常压等离子体突变，在其中含有多种化学活性成分粒子。

3）基于PCR技术的突变

随机突变、定点突变、易错PCR、基因重排、定向进化（建库）。

易错PCR：在采用DNA聚合酶进行PCR时，通过调整反应条件，比如说加入镁离子、加入锰离子、改变体系中的dNTP、低保真的酶等，来改变基因频率，以此达到基因突变的效果。

基因重排：将含有不同大小的基因库切成DNA小片段，小片段之间互为引物进行PCR扩增，扩增含有多个突变位点的基因，转化筛选。

定向进化：突变文库构建（基于易错PCR以及基因文库的建立），定向筛选（按照定向有目的筛选），基因鉴定（扩增目标基因，进行鉴定）

PCR对基因的改造缺点：只能对单基因进行改造，一般的酶分子不要过大，只能针对酶本身进行改造，往往适应性不好，效果有限。

4）有性选育：杂交育种、原生质体融合、基因组重排。

杂交育种：是将父母本杂交之后得到子代，对子代进行选育。

原生质体融合：采用人工的方法，将两个有一定性状的原生质体进行融合从而达到育种目的。

基因组重排：基因组重排需要一个基因库，然后通过原生质体融合的方式将目的基因进行随即重排。

第六章 酶的分离纯化

1.分离纯化的概要

1）酶蛋白纯化的一般过程：合适的方法选取、蛋白质来源及释放、初步分离、纯化、脱盐浓缩、检测保存

2）纯化常规需要考虑

量：科研级别（微克）；医药上和工业上（公斤级），

纯度：临床治疗99.9%，食品级安全

破碎条件：温和，去除杂志、脂质、核酸、毒素等物质。

纯化条件：缓冲体系，蛋白酶，稳定性

2.蛋白质的初步纯化——分离

1）细胞破碎：机械破碎法、化学破碎法、物理破碎法（压力差、温度差、超声）、酶促破碎法。

2）提取：

盐溶液提取：麸曲中的淀粉酶、蛋白酶等胞外酶。

酶溶液提取：胰蛋白酶的提取

碱溶液提取：细菌L—天冬酰胺酶

有机溶剂萃取：有机相、水相，多用于与脂质可以牢固结合或者有较多极性基团的酶提取。

3）沉淀分离：

盐析：利用不同蛋白质在不同溶液当中的溶解度不同进行分离，通过在酶溶液中加入一定浓度的盐使酶或者杂质析出沉淀，从而达到沉淀分离的作用。

等点点沉淀：利用两性电解质在等电点的溶解度最低，以及不同的良性电解质有不同的等电点这个特征，通过调节溶液的pH，是没或者杂质析出。

有机溶剂沉淀法：利用酶或者其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的有机溶剂，是没或者杂志析出。

复合沉淀：在酶中加入某种物质，使之与酶形成复合物，而沉淀下来。

选择性变性沉淀：选择一定条件使酶液中存在杂质，并且不会影响酶的作用效果。

4）离心分离

差速离心：根据粒子大小、沉降系数等进行离心。

密度梯度离心：在密度梯度离心介质（蔗糖、甘油）进行离心。

等密梯度离心：将介质与样品混合，由于各自的浮力上浮或者下沉。

5）膜分离：粗滤、微滤、超滤

3.蛋白质的精细纯化

1）色谱层析：吸附层析和分配层析（纸上层析和簿层层析）

2）不同层析的原理

3）分子排阻

4）离子交换层析

5）层析聚焦

6）疏水层析

4.高效液相色谱法

第七章 酶的性质

1.酶的基本性质

1）检测

SED-PAGE

WB：是否为特异性蛋白

LC-MS/GC-MS：含量以及分子量

CD：研究蛋白质的二级结构

紫外扫描/分光光度法：浓度

DSC：通过吸放热的特殊点发生蛋白质溶解点进行蛋白质分子连接点的研究。

晶体结构：冷冻电镜

2）酶的基本性质

酶活：是指在一定条件下酶催化反应的能力

酶活力大小：一定条件下酶催化反应的速率

酶单位：一定条件下一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。

酶转换数（Kcat）：一定条件下每秒钟每个酶分子转换的底物分子数来表示酶的反应速率。

抑制剂：分子直接作用于酶，导致其催化效率较低的物质叫做酶抑制剂。

3）酶学特征检测

2.酶的稳定性

金属离子、底物、辅因子、其他相对低分子的分子质量陪提的结合作用。

盐桥、二硫键、氢键、

3.酶的变性机制

1）化学变性因素：

表面活性剂、去污剂：阴离子>阳离子>无离子

变性剂：脲和盐酸胍

高浓度盐：硫酸铵、酶稳定剂

氰化钠（紊乱剂）

有机溶剂

螯合

重金属离子和巯基试剂

2）物理变性因素：热、机械力、冷冻脱水、辐射作用

3）蛋白复性：不在完全不可逆失活的条件下，大多数蛋白质可以复性。也就是重新具有酶的功能。

4）不可逆失活：

蛋白质水解酶和自溶作用：微生物或者外源蛋白水解酶的作用。

聚合作用：热变性、二硫键重组

极端pH：启动改变、交联破坏氨基酸残基

氧化作用：芳香族的侧链氨基酸、蛋氨酸、半胱氨酸，胱氨酸残基

4.酶的保存：保存条件状态、温度、水分、氧气、保护剂。固定化、酶分子修饰

第八章 酶的保存

1.酶抑制剂

1）抑制剂：直接作用于酶使其翠花效率降低的分子。

2）酶抑制剂的应用：治疗或者有毒

抑制作用类型：分为可逆抑制和不可逆抑制，可逆抑制又可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。

可逆抑制：可逆抑制是说对反应的一直是可逆的，以酶促反应来说，可逆性抑制剂与酶形成复合物，抑制酶与底物的作用。但是在相同条件下，复合物又可以分解成酶和抑制剂，分解后的酶仍然可以催化反应的发生。

竞争性抑制：抑制剂与底物共同竞争美的同一个活性位点，从而干扰了底物与酶的结合。

非竞争性抑制：抑制剂可与酶的其他活性部位结合，但不会和底物竞争同一个活性部位。

反竞争性抑制：抑制剂不能与游离酶发生结合，但是可以与底物—酶的复合物发生结合，从而抑制酶促反应。

不可逆抑制：共价修饰改变酶的结果，不可逆转。大豆胰蛋白酶抑制剂只不可逆作用于多肽，青霉素亚砜只不可逆作用于内酰胺酶。

3）酶抑制剂的应用

神经毒气乙酰胆碱酯酶

达菲竞争性抑制流感

第九章 动植物及其细胞产酶

1.动物细胞及动物细胞产酶

1）概述

动物组织中有些酶的含量很高，可以直接提取，利用动物细胞额方法也可以产生大量的酶

2）动物细胞产酶的特点：易获取、动物来源、病毒、含量、纯度不高、可持续性不长。

3）动物产酶举例

蜗牛酶的提取：蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中植被的混合酶，含有纤维须眉，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等多种酶。

破壳，摘嗦囊，2-3倍缓冲液，过滤取滤液，冻干极为成品。

胰蛋白酶提取和精细纯化。

豚鼠肝脏中 TG酶

4）动物细胞产酶特点：

用于功能蛋白的生产

生产缓慢

需要添加抗生素

对剪切力面干、培养条件苛刻

有些只能贴壁培养。

培养基复杂，需要血清或替代品，价格昂贵。

5）动物细胞培养工艺

悬浮培养、贴壁培养、固定化细胞培养

培养基：氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、生长因子、激素

温度：36.5

6）重组蛋白表达

构建表达载体

选择合适的宿主细胞

有话培养基

优化纯化工艺

2.植物细胞产酶

1）概述半贴壁单层细胞室温可以生长，表达的重组蛋白可溶，折叠正确有翻译后修饰，有生物活性，比较容易分离，易于表达异源蛋白，安全

2）产酶方式

植物组织直接提取

愈伤组织培养

转基因植物

植物细胞培养

原生质体培养

3）植物细胞培养

细胞体积大，营养条件相对简单，产率提高，所短周期，易于管理、需要的条件较多（外界条件，修剪等）

4）植物组织培养

选择和处理外植体，分离细胞，愈伤组织诱导培养、细胞培养、原生质体再生培养

5）示例：蒜素和蒜酶超氧化物歧化酶、木瓜蛋白酶（提取炼乳，凝固，陈江，干燥、麦芽糖酶。